Investigación de la leucemia mieloide aguda mediante el desarrollo de modelos in vitro e in vivo

Doctoranda: Elisa González Romero. Grupo de investigación en Hematología y Hemoterapia del IIS La Fe.

Directores: Dr. Rafael Vázquez, Dr. José Cervera, Dr. Miguel Ángel Sanz.

Resumen:

La leucemia mieloide aguda (LMA) es un grupo heterogéneo de desórdenes hematológicos producidos por alteraciones genéticas en las células precursoras mieloides. Se trata de una enfermedad biológicamente compleja, en la que están implicadas un gran abanico de alteraciones genómicas. Para comprender en que forma las mutaciones producen el inicio y la progresión de la leucemia, los modelos de investigación juegan un papel esencial, pero las líneas celulares leucémicas son difíciles de trabajar y presentan eficiencias de transfección muy bajas.

Por ello, en esta tesis se han desarrollado nuevas estrategias para desarrollar de forma fácil y sencilla modelos in vitro e in vivo de mutaciones asociadas a la LMA. Para el desarrollo de esta metodología, escogimos modelizar las mutaciones en el gen de la enzima isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) empleando la revolucionaria herramienta de edición génica CRISPR/Cas9.
Para generar modelos in vitro hemos desarrollado una estrategia sencilla y eficiente para introducir los elementos del sistema CRISPR.
Por un lado, hemos creado un plásmido de ADN codificante del sitio de clonación del elemento guía del sistema de edición y del gen codificante de la proteína verde fluorescente GFP.

Mediante una serie de reacciones de PCR con cebadores específicos, este vector permite generar guías de ADN contra el gen de interés, y de forma opcional con el gen codificante de GFP, que permite hacer un seguimiento de la transfección celular y seleccionarlas. Por otro lado empleamos lentivirus con capacidad integrativa para insertar el gen codificante de la nucleasa en el genoma de líneas celulares leucémicas, generando líneas que expresan de forma constitutiva la Cas9.

Con esta estrategia conseguimos eficiencias de edición similares a otras estrategias más extendidas, como el uso de complejos de ribonucleoproteínas (RNP). Estas eficiencias de edición permiten desarrollar y seleccionar de una más fácil aquellas células que presenten los cambios deseados, que puede ser tanto la introducción de una mutación que se desea estudiar o su corrección.
Por otro, debido al papel esencial del gen IDH2 en el ciclo de Krebs, el gen ortólogo idh-2 en el organismo Caenorhabditis elegans presenta una gran homología, incluidas las regiones que se encuentran mutadas en la LMA. Esto nos ha permitido producir nuevas cepas de C. elegans con las mutaciones más frecuentes en este gen mediante la estrategia co-CRISPR. Esta estrategia consiste en modificar, además de nuestro gen de interés, un gen que altera la morfología del gusano, haciendo que se fácil de identificar aquellos donde la maquinaria de edición génica ha tenido éxito y es más probable que presenten nuestra modificación de interés.

Estas nuevas estrategias permitirán el desarrollo de modelos de investigación de una forma rápida, sencilla y eficiente que permitirán el estudio en profundidad del papel de las alteraciones genómicas encontradas en los pacientes de LMA, descubrir nuevos biomarcadores y podrían emplearse para testar nuevos fármacos.

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